جداسازی و شناسایی عامل ضد انعقاد خون از زهر مار افعی قفقازی ایران

آنزیم های سرین پروتیاز (serine protease enzymes) یکی از مهمترین ترکیبات موجود در زهر مار می باشند که مطالعات زیادی جهت جداسازی و شناسایی آنها صورت گرفته است. این آنزیم ها توانایی شکستن فیبرینوژن(همانند ترومبین) و تشکیل فیبرینوپپتیدهای a یا فیبرینوپپتیدهای b یا هر دو را دارند. آنزیمهای سرین پروتیاز حاصل از زهر مارها، به خانواده ی پروتیازها تعلق دارند که درin vivo خون را لخته می کنند. این آنزیمها هنگامیکه در in vitro عمل می کنند با کاهش فیبرینوژن در گردش خون، از انعقاد آن جلوگیری می کنند. در این تحقیق، زهر مار افعی قفقازی با استفاده از روشهای کروماتوگرافی شامل یک مرحله ژل کروماتوگرافی بر روی سفادکسg50، کروماتوگرافی تبادل یونی بر روی deae- سفاروز cl-6b و hplc بر روی ستون c18 مجزا شده، فعالیت انعقادی فراکسیونهای مختلف جدا شده به کمک تست pt سنجیده شد. در شروع کار، با استفاده ژل کروماتوگرافی بر روی سفادکسg50 زهر مار افعی قفقازی به فراکسیونهای مختلف تفکیک شده و فعالیت انعقادی فراکسیونهای مختلف جدا شده به کمک تست pt سنجیده شد. از ژل کروماتوگرافی پنج فراکسیون بدست آمد که اولین فراکسیون خاصیت انعقادی و فراکسیون دوم خاصیت ضدانعقادی داشت. فراکسیون دوم که حاوی عامل ضدانعقادی بود برای تخلیص بیشتر به ستون کروماتوگرافی تبادل یونی deae- سفاروز cl-6b تزریق شده و فعالیت انعقادی فراکسیونهای مختلف جدا شده به کمک تست pt سنجیده شد. فراکسیون اول کروماتوگرافی تبادل یونی خاصیت ضدانعقادی داشت. از 182 میلی گرم زهرخام مار افعی قفقازی مصرف شده حدود 75/21 میلی گرم عامل ضدانعقادی بدست آمد که 21ah نامیده شد. وزن ملکولی این عامل ضد انعقادی توسط ژل الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات پلی اکریل آمید در حدود kda22 تخمین زده شد. مقدار پروتیین ضدانعقادی تخلیص شده، چیزی در حدود 12% وزن زهر خام بود. این عامل در غلظتهای بالاتر از µg/ml 100 موجب عدم انعقاد در تست pt شد؛ درحالیکه µg/ml 10، پایین ترین غلظتی بود که این عامل در تست pt اثر ضدانعقادی به جای گذاشت. فراکسیون اول حاصل از ژل کروماتوگرافی که خاصیت ضدانعقادی داشت بر روی ستون کروماتوگرافی تبادل یونیdeae - سفاروز cl-6b برده شده و فراکسیون ضدانعقادی حاصل به hplc دارای ستون c18 تزریق شد. در مرحله نهایی تخلیص دو آنزیم سرین پروتیاز بدست آمد. از 182 میلی گرم زهر تزریق شده به ستون حدود 52/1 میلی گرم آنزیم سرین پروتیاز بدست آمد؛ آنزیمهای سرین پروتیاز تخلیص شده با عناوین 143ah و 144ah نامیده شدند. وزن ملکولی این آنزیمها توسط ژل الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات پلی اکریل آمید، بترتیب در حدود kda 32 و kda 5/32 تخمین زده شد. آنزیمهای تخلیص شده 143ah و 144ah بر روی پلاسما اثر انعقادی داشتند. هپارین و edta بر روی هیچکدام از آنزیمهای 143ah و 144ah اثر بازدارندگی نداشتند. این آنزیمها در گستره ph های 5 تا 10 دارای فعالیت بودند و ph بهینه برای فعالیت این آنزیمها 5/7 بود؛ خارج از این گستره، آنزیمهای تخلیص شده بسرعت فعالیت خود را از دست دادند. این دو پروتیاز در دمای c? 37 بیشینه فعالیت خود را داشتند؛ با افزایش دما این آنزیمها بسرعت فعالیت خود را از دست دادند و در نهایت در دمای c ?60 بطور کامل غیر فعال شدند. با توجه به ویژگیهای آنزیمهای تخلیص شده 143ah و 144ah، آنها بعنوان آنزیمهای شبه ترومبین معرفی شدند.